Nytt nukleinsyradetektionskit för Coronavirus(SARS-Cov-2).
New Coronavirus(SARS-Cov-2) Nucleic Acid Detection Kit
(Flumalmscent RT-PCR Probe Method) Product Manual
【Product name 】Nytt Coronavirus(SARS-Cov-2) nukleinsyradetektionskit (fluorescerande RT-PCR-sondmetod)
【Packaging specifications 】25 tester/kit
【Intended usåldras】
Detta kit används för kvalitativ detektering av nukleinsyra från nytt coronavirus i nasofaryngeala pinnprover, orofaryngeala pinnar (hals) pinnar, främre nasala pinnar, mid-turbinate pinnar, nasala sköljningar och nasala aspirater från individer som misstänks för covid19 av sin vårdgivare. Detekteringen av ORF1ab- och N-gener från det nya coronaviruset kan användas för hjälpdiagnos och epidemiologisk övervakning av ny coronavirusinfektion.
【Principles of the procedure 】
Detta kit är designat för specifika TaqMan-prober och specifika primers designade för de nya coronaviruset (SARS-Cov-2) ORF1ab och N-gensekvenserna. PCR-reaktionslösningen innehåller 3 uppsättningar av specifika primrar och fluorescerande prober för specifik detektering av mål, och ytterligare en uppsättning specifika primers och fluorescerande prober används som intern standardkontroll av kitet för att detektera endogena hushållsgener.
Testprincipen är att den specifika fluorescerande sonden spjälkas och bryts ned av exonukleasaktiviteten av Taq-enzymet i PCR-reaktionen, så att reporterfluorescensgruppen och den släckta fluorescerande gruppen separeras, så att fluorescensövervakningssystemet kan ta emot en fluorescerande signal, och sedan genom anrikningseffekten av PCR-amplifiering når fluorescenssignalen för sonden ett inställt tröskelvärde-Ct-värde (cykeltröskel). I fallet med ingen målamplikon är probens reportergrupp nära den släckande gruppen. Vid denna tidpunkt sker överföring av fluorescensresonansenergi, och fluorescensen av reportergruppen släcks av den släckande gruppen, så att den fluorescerande signalen inte kan detekteras av det fluorescerande PCR-instrumentet.
För att övervaka användningen av reagenser under testet är kitet utrustat med positiva och negativa kontroller: den positiva kontrollen innehåller målställets rekombinanta plasmid och den negativa kontrollen är destillerat vatten, som används för att övervaka miljöföroreningar. Det rekommenderas att ställa in en positiv kontroll och en negativ kontroll samtidigt vid testning.
【Main components 】
Cat. No. | BST-SARS-25 | BST-SARS-DR-25 | Components | |
Name | Specifiering | Kvantity | Kvantity | |
Positiv kontroll | 180 μL/flaska | 1 | 1 | Artificiellt konstruerade plasmider, destillerat vatten |
Negativ kontroll | 180 μL/flaska | 1 | 1 | Destillerat vatten |
SARS-Cov-2-blandning | 358,5 μL/flaska | 1 | / | Specifika primerpar, specifika detektionsfluorescerande prober, dNTPs, , MgCl2, KCl, Tris-Hcl, destillerat vatten, etc. |
Enzymmix | 16,5 μL/flaska | 1 | / | Taq-enzymer, omvänt transkriptas, UNG-enzymer, etc. |
SARS-Cov-2-blandning (frystorkad) | 25 tester/flaska | / | 1 | Specifika primerpar, specifika detektionsfluorescerande prober, dNTPs, Taq-enzymer, omvänt transkriptas, destillerat vatten, etc. |
2x buffert | 375 μL/flaska | / | 1 | MgCl2, KCl, Tris-Hcl, destillerat vatten, etc. |
Notera:(1) Komponenterna i olika batchsatser kan inte blandas eller bytas ut.
(2) Förbered ditt eget reagens: Nukleinsyraextraktionssats.
【Storage conditions och expiration date 】
For BST-SARS-25:Transportera och förvara vid -20±5℃ under lång tid.
For BST-SARS-DR-25:Transportera i rumstemperatur. Förvara vid -20±5℃ under lång tid.
Undvik upprepade frys-upptiningscykler. Giltighetstiden är preliminärt satt till 12 månader.
Se etiketten för tillverknings- och användningsdatum.
Efter första öppning kan reagenset förvaras vid -20±5 °C i högst 1 månad eller till slutet av reagensperioden, beroende på vilket datum som kommer först, för att undvika upprepade frys-upptiningscykler och antalet reagensfrysta -upptiningscykler bör inte överstiga 6 gånger.
【Applicable instrument】ABI 7500, SLAN-96P, Roche-LightCycler-480.
【Sample requirements 】
1. Tillämplig provtyp: Extraherad nukleinsyralösning.
2. Förvaring och transport av prov: Förvara vid -20±5 ℃ i 6 månader. Frys in och tina proverna högst 6 gånger.
【Testing method】
1.Nucleic acid extraction
Välj ett lämpligt nukleinsyraextraktionskit för att extrahera viral nukleinsyra och följ motsvarande kitinstruktioner. Det rekommenderas att använda ett nukleinsyraextraktions- och reningskit tillverkat av Yixin Bio-Tech (Guangzhou) Co., Ltd. eller motsvarande nukleinsyrareningskit.
2. Reaction reagent preparation
2.1 For BST-SARS-25:
(1) Ta bort SARS-Cov-2-blandningen och enzymblandningen, smält helt vid rumstemperatur, blanda noggrant med Vortex-anordning och centrifugera sedan kort.
(2) 16,5 uL Enzyme Mix sattes till 358,5 uL SARS-Cov-2 Mix och blandades noggrant för att erhålla den blandade reaktionslösningen.
(3) Förbered ett rent 0,2 mL PCR-oktalrör och märk det med 15 µl av ovanstående blandade reaktionslösning per brunn.
(4) Tillsätt 15 μL renad nukleinsyralösning, den positiva kontrollen och den negativa kontrollen, och täck försiktigt över det oktala röret.
(5) Blanda väl genom att vända upp och ner och centrifugera snabbt för att koncentrera vätskan i botten av röret.
1
2.2 For BST-SARS-DR-25:
( 1) Tillsätt 375 ul 2x buffert till SARS-Cov-2 Mix ((frystorkad) för att förbereda reaktionsblandningen. Blanda noggrant genom att pipettera och centrifugera sedan kort. (När reaktionsblandningen är beredd, rekommenderas att den förvaras vid -20 ℃ vid långtidsförvaring.)
(2) Förbered ett rent 0,2 mL PCR-oktalrör och märk det med 15 μL reaktionsblandning per brunn.
(3) Tillsätt 15 μL renad nukleinsyralösning, den positiva kontrollen och den negativa kontrollen, och täck försiktigt över det oktala röret.
(4) Blanda väl genom att vända upp och ner och centrifugera snabbt för att koncentrera vätskan i botten av röret.
3. PCR amplification (Se instrumentmanualen för driftsinställningar.)
3. 1 Placera PCR 8-röret i provkammaren på det fluorescerande PCR-instrumentet och ställ in provet som ska testas, den positiva kontrollen och den negativa kontrollen enligt laddningsordningen.
3.2 Fluorescensdetektionskanal:
(1) ORF1ab-genen väljer detektionskanalen för FAM (Reporter: FAM, Quencher: Ingen).
(2) N-genen väljer detektionskanalen för VIC (Reporter: VIC, Quencher: Ingen).
(3) Intern standardgen väljer detektionskanalen för CY5 (Reporter: CY5, Quencher: Ingen).
(4) Den passiva referensen är inställd på ROX.
3.3 PCR-programparameterinställning:
Steg | Temperatur (℃) | Tid | Antal cykler | |
1 | Omvänd transkriptionsreaktion | 50 | 15 min | 1 |
2 | Taq enzymaktivering | 95 | 2,5 min | 1 |
3 | Taq enzymaktivering | 93 | 10 s | 43 |
Glödgningsförlängning och fluorescensupptagning | 55 | 30 s |
Efter inställning, spara filen och kör reaktionsprogrammet.
4.Results analysis
Efter att programmet avslutats sparas resultaten automatiskt och amplifieringskurvan analyseras. Förstärkningskurvan är inställd på instrumentets standardtröskel.
【Explanation of test resuDess 】
1. Bestäm experimentets giltighet: Den positiva kontrollen FAM, VIC-kanalen bör ha en typisk förstärkningskurva och Ct-värdet är i allmänhet mindre än 34, men kan fluktuera på grund av olika tröskelinställningar för olika instrument. Den negativa kontrollen FAM, VIC-kanalen bör vara icke-förstärkt Ct. Man är överens om att ovanstående krav samtidigt måste uppfyllas, annars är detta test ogiltigt.
2. Resultatbedömning
FAM/VIC-kanal | Dom resultat |
Ct<37 | Provprovet är positivt |
37≤Ct<40 | Amplifieringskurvan är S-formad och misstänkta prover måste undersökas på nytt; om omtentamensresultaten är konsekventa bedöms det som positivt, annars är det negativt |
Ct≥40 eller ingen förstärkning | Provtestet är negativt (eller under den nedre gränsen för kitdetektion) |
Notera: ( 1) Om både FAM-kanalen och VIC-kanalen är positiva samtidigt, bedöms SARS-Cov-2 vara positiv.
(2) Om FAM-kanalen eller VIC-kanalen är positiv och den andra kanalen är negativ, bör testet upprepas. Om den samtidigt är positiv kommer den att bedömas som SARS-Cov-2 positiv, annars kommer den att bedömas som SARS-Cov-2 negativ.